BioArt按：今天，JnnifrDoudna和EmmanullCharpntir获得诺奖，被很多人认为实至名归。然而重大的科学发现经常是站在巨人肩上获得的，在CRISPR基因编辑技术发现史上，还有很多英雄，虽然他们没有获得诺奖，但是他们的贡献是伟大的。关于CRISPR基因编辑技术发现史已有无数的文章过去报道过，但是最有影响的还是年1月14日，Cll杂志发表的美国哈佛-MITBroad研究所教授EricLandr撰写的一篇关于CRISPR基因编辑技术发现史的综述文章，文章甫一发表就激起了文章中的一些当事人强烈的反应，其中CRISPR技术的开拓者和发明人之一JnnifrDoudna就公开对一些事实进行了驳斥。回顾CRISPR基因编辑技术发现史，这是一篇无法绕过的文章，今日重新发布，温故知新，对关键论文的截图进行了更新，以飨读者！CRISPR英雄谱原文丨埃里克·兰德（EricLandr）小鹿/译Cll杂志原文截图EricLandr教授第一时间发出的祝贺摘要三年之前，科学家们宣布，CRISPR技术能够对真核活细胞进行精准与有效的基因组编辑。自此，这项技术手段已然震撼了科学界，数以千计的实验室正在将其运用于从生物医药到农业的各个领域。然而，从一种奇特的细菌重复序列现象的发现开始，到确认这种现象为适应性免疫系统，进而对它的生物功能特性的了解，直至开发为一项基因工程的技术，这此前二十载相关的研究历程却不为人所知。本文正是着眼于填补这段科学历史的空白，它讲述的是观念的演化历史和先锋人物的传奇故事，并且从中获得关于支撑科学发现的优秀科研环境的启迪。前言很难想起曾经有哪一次科学革命像CRISPR这般如此迅速地改变生物学界。仅仅三年之前，科学家宣布，CRISPR系统，即细菌通过纪录和精准攻击入侵病毒的DNA序列而进行自身防御的适应性免疫系统，可以利用转化为一项简单而有效的技术在哺乳动物和其它生物体的活体细胞内进行基因组编辑。CRISPR即此被全球数以千计的实验室运用于广泛的领域，如创建人类遗传疾病和癌症的复杂动物模型；在人类细胞内进行全基因组筛选从而精确定位作用于生理过程的具体基因；开启或关闭某个特定基因的作用；改变植物的基因。CRISPR有可能用于改变人类生殖系统的前景引发了全球范围的争论。虽然我还没见过没有听说过CRISPR的分子生物学家，但是，你如果问他们到底这项科学革命是如何发生的，他们往往一头雾水。免疫学家彼得?梅达沃爵士（SirPtrMdawar）有云：“科学的历史会让大多数科学家感到无聊透顶”（Mdawar，）。的确，科学家总是义无反顾地专注于未来。一旦一项事实在科学上得到确立，那么通向发现此事实的迂回路径则被归为无关紧要的轶闻。然而，科学突破背后的科学家的故事可以使我们对于善于激发生物医药进步的这种神奇的科研环境有更多了解：有关灵感与规划，纯粹好奇心与实践运用，“无假设驱动（Hypothsis-fr）”与“假设驱动（Hypothsis-drivn）”的研究方法，个人与团队，新颖的视角和深厚的专业知识在其中发挥的各自功能。这些理解对于政府和基金会都尤为重要，因为仅在美国，这些组织就在生物医药研究领域一共投资了超过四百亿美元。对于常常把科学家想象为离群索居于实验室的孤独天才的普通公众，这些理解也同样重要。此外，对于正在接受科学训练的科学学徒而言，能对科学职业生涯有一个现实的图景式的把握，并将其作为导向和激励，更是十分有益。在过去的几个月里，我一直试图理解CRISPR背后的20年的前程往事，这其中包括科学观念的历史和科学家的个人经历。本文的视角是建立在已发表的论文，个人访谈和其它材料（含期刊拒绝信）的基础之上的。最后，我尝试从其中得出一些普遍的经验。（作为背景，图1提供了一个对II型CRISPR系统的简要概述，正是这一种类被转化利用于基因组编辑。）本文的关键内容是描述了一群踌躇满志的科学家偕同他们的合作者和其它未能详述的贡献者一起发现了CRISPR系统，揭开它分子机制的面纱，并将它转化利用为生物与生物医药研究的强大工具。他们共同列名于CRISPR英雄谱。CRISPR的发现故事开始于西班牙白色海岸上的地中海港口圣波拉（SantaPola），那里的美丽的海岸与广阔的盐沼地几个世纪以来吸引着度假客、火烈鸟和盐业生产商（这个故事的地理如图2所示）。FranciscoMojica就在附近长大，常常光顾这片海滩，自然而然，当他于年开始在位于海岸上端的阿利坎特大学（UnivrsityofAlicant）作博士研究的时候，他加入了一个研究地中海嗜盐菌（Halofraxmditrrani）的实验室，这是一种从圣波拉的沼泽分离出的具有极端耐盐性的古细菌。他的导师发现，培养基的盐含量似乎会影响限制性内切酶切割此微生物的基因，Mojica于是开始鉴定这一异种片段。在他检查的第一个DNA片段里，Mojica发现了一个奇怪的结构，即一个近乎完美的大致呈回文式对称、有30个碱基并被36个碱基的间隔隔开的多拷贝重复序列，而它与任何已知的微生物的重复序列家族都不相同（Mojica等，）。图2这个28岁的研究生被此深深吸引，并且将他接下来的十年学术生涯贡献给了破解这一神秘现象。他不久在相近的沃氏嗜盐富饶菌（H.volcanii）和关系更远的嗜盐古菌中还发现类似的重复序列。在梳理科学文献过程中，他发现了这一现象与真细菌的关联：一个日本研究组(Ishinotal.,)的一篇论文提到在大肠杆菌（Eschrichiacoli）中的一个重复序列有相似的结构，虽然与嗜盐菌（Halofarax）的重复没有序列的相似性。论文的作者们对这一现象并未深究，但是Mojica意识到，在关系如此远的微生物上存在如此相似的结构一定意味着一个尚未被发现的原核细胞里的重要功能。在去牛津作短暂的博士后研究之前，他写了一篇论文报道了这一新的重复序列类别(Mojica等,)。Mojica之后返回阿利坎特大学担任教职。由于学校缺乏启动科研基金和实验室空间，他只好转而通过生物信息学的方法来研究这种奇怪的重复，并将其命名为shortrgularlyspacdrpats(SRSPs)。这一名称在他自己的建议下后来改为“聚集的规律插入间隔回文重复”（ClustrdRgularlyIntrspacdPalindromicRpats，CRISPR)(Jansn等,;Mojica和Garrtt,)。到年，Mojica已在20个不同的微生物上发现了CRISPR基因位点，其中包括结核分枝杆菌（Mycobactriumtubrculosis），艰难梭菌（Clostridiumdifficil），和鼠疫杆菌（Yrsiniapstis）(Mojica等,).。在两年的时间内，研究人员已经将这相关微生物的名录翻倍并且列录了基因位点的关键特征，包括存在近亲缘的特定的“CRISPR关联基因”（cas基因），这通常认为与他们的功能相关(Jansn等,)。（列表1列举了CRISPR系统的最新分类。）表1但是，CRISPR系统的功能究竟是什么呢？各种假设层出不穷：比如设想与基因调控，复制分区，DNA修复还有其它功能有关。然而大多数的这类假设都没有证据支持，它们一个一个都被证伪了。如同CRISPR的发现一样，重要的睿见来自于生物信息学。CRISPR是一种适应性免疫系统年8月的假期，Mojica避开圣波拉的酷暑，躲在阿利坎特的空调办公室里。如今已然作为初兴的CRISPR领域的领军人物，他将目光从重复序列转向分隔它们的间隔序列。使用文字处理器，Mojica不辞辛劳地抽出每一个间隔并将其插入BLAST软件来搜索与其它任何已知DNA序列的相似性。虽然他尝试这种方法失败过，但是DNA序列数据库在不断扩大，这一次他成功掘到金矿了。在他最近从一种大肠杆菌菌株测序到的一个CRISPR基因位点上，其中一个间隔与一种P1噬菌体的序列相匹配，而这一噬菌体可以感染多种大肠杆菌菌株。然而，携带这一间隔的菌株已知对P1感染具有抵抗力。那一周结束时，他已经检索了个间隔。其中88个间隔与已知序列相似，三分之二同携带间隔的微生物相关的病毒或接合质粒相匹配。Mojica意识到CRISPR基因位点储存了用于为保护微生物抵抗感染的适应性免疫系统所需的信息。Mojica于是和同事们一起外出饮干邑白兰地庆祝，并在第二天清晨开始撰写相关论文。如此竟开始了长达18个月的痛苦煎熬。认识到这一发现的重要性，Mojica将论文投给了《自然》（Natur）。年11月期刊在未征询外部评审的情况下拒绝的论文的发表。难以理解的是，编辑声称论文的关键论点属于已知范畴。年1月，《美国国家科学院院刊》（PNAS）的决定是这篇论文缺乏“充足的新颖观点和重要性”因而不够资格送审。《分子微生物学》和《核酸研究》（NAR）也相继地拒绝发表。此时，绝望而又担心被别人抢先一步发表的Mojica将论文投给了《分子演化杂志》。在经过12个多月的审稿和修订，这篇宣布CRISPR可能功能的论文终于在年2月1日发表了(Mojicat等,)。与此同时，CRISPR正是另一个意想不到的地点的研究人员的
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